As Estruturas da Vida
As Estruturas da Vida em PDFCristalografia de raios-X: união da arte com a ciência
Como examinar a forma de algo demasiado pequeno para poder ser visto até no mais poderoso microscópio? Os cientistas que tentam visualizar os complexos arranjos de átomos dentro das moléculas têm exatamente esse problema, que resolveram de forma indireta. Usando uma ampla coleção de moléculas idênticas – por vezes proteínas – em conjunto com equipamento especializado e técnicas de modelação computacional, os cientistas são capazes de calcular a aparência de uma molécula isolada.
Os dois métodos mais comummente usados na investigação de estruturas moleculares são a cristalografia de raios-X (também chamada difração de raios-X) e a espetroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Os investigadores que usam a cristalografia de raios-X têm que obter cristais sólidos das moléculas que estudam. Os que usam a RMN estudam as proteínas em solução. Cada técnica tem as suas vantagens e desvantagens. Juntas, oferecem um precioso vislumbre das estruturas da vida.
Mais de 85% das estruturas proteicas que conhecemos foram determinadas usando a cristalografia de raios-X. Essencialmente, os cristalógrafos lançam um feixe potente de raios-X a um pequeno cristal que contém biliões de moléculas idênticas. O cristal desvia os raios-X para um detetor, como uma bola de espelhos que reflete a luz numa pista de dança. O detetor eletrónico é do mesmo tipo dos que são usados para captar imagens nas câmaras digitais.
Após cada descarga de raios-X, que dura desde poucos segundos até várias horas, os investigadores rodam o cristal com muita precisão, inserindo a orientação desejada no computador que controla o aparelho de raios-X. Isto permite que os cientistas captem, a três dimensões, o modo como o cristal dispersa, ou difrata, os raios-X.
A intensidade de cada raio difratado é registada num computador, que usa uma equação matemática, designada
transformada de Fourier, para calcular a posição de cada átomo na molécula cristalizada.
O resultado – a obra de arte do investigador – é uma imagem digital da molécula a três dimensões. Esta
imagem representa as propriedades físicas e químicas da substância e pode ser estudada com detalhe, átomo a átomo,
usando um sofisticado software de computação gráfica.
Cozinha de cristais
Um aspeto essencial da cristalografia de raios-X é a obtenção de cristais de alta qualidade. Os melhores cristais são puros, perfeitamente simétricos, reunindo moléculas numa estrutura tridimensional bem organizada. Podem ter diferentes formas, desde cubos perfeitos até agulhas alongadas. A maioria dos cristais usados nestes estudos são quase invisíveis (com menos de um milímetro de lado). Mas, quanto maior for o cristal, mais precisos são os dados e mais facilmente se desvenda a estrutura.
Usando a cristalografia de raios-X, os cientistas podem estudar vírus enormes que contêm várias
centenas de proteínas. Mavis Agbandje-McKenna utiliza esta técnica para investigar de que modo os vírus infectam as
células. Podes ler sobre o seu
invulgar percurso pessoal e científico, desde uma vila rural na Nigéria até à University of Florida em
Gainesville, no sítio de internet em http://publications.nigms.nih.gov/findings/mar06/voyages.html (sítio em inglês).
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Os cristalógrafos
"fazem crescer" os seus minúsculos cristais em placas de plástico. Geralmente começam com uma solução muito
concentrada da molécula. Depois, misturam essa solução com uma série de líquidos cuidadosamente preparados para formarem
pequenas gotículas (1-10 microlitros). Cada gotícula é mantida numa placa ou poço separados. À medida que o líquido se vai
evaporando, as moléculas em solução ficam progressivamente mais concentradas. Durante este processo, as moléculas
distribuem-se num padrão tridimensional preciso e eventualmente cristalizam – se o investigador tiver sorte.
Por vezes, são
necessários meses ou até mesmo anos para obter os cristais. As condições – temperatura, pH (acidez ou alcalinidade)
e concentração – devem ser perfeitas. E como cada tipo de molécula é diferente, é necessário que os cientistas
testem novas condições de cristalização para cada nova amostra.
Mesmo assim, algumas moléculas não colaboram. Podem ter secções mais frouxas que vibram demasiado para se poderem organizar num cristal. Ou, particularmente no caso das proteínas que normalmente estão embebidas em membranas celulares lipídicas, a molécula pode ser incapaz de se dissolver completamente na solução.
Alguns cristalógrafos mantêm os seus cristais em formação em câmaras seladas para evitar que qualquer deslocação de ar acidental os perturbe. Outros insistem num ambiente livre de vibrações – pelo menos num caso, de música rock. Outros ainda brincam com as fases da Lua e fenómenos sobrenaturais. Tal como a brincadeira sugere, obter cristais continua a ser uma das partes mais difíceis e imprevisíveis da cristalografia de raios-X. É o que mistura a arte com a ciência.
Cristais à chamada
Embora os cristais usados em cristalografia de raios-X sejam quase invisíveis a olho nú, contêm um vasto número
de moléculas idênticas e ordenadas com precisão. Um cristal de 0,5 milímetros de lado contém cerca de
1 000 000 000 000 000
(ou 1015) moléculas proteicas de tamanho médio.
Quando os cristais estão completamente formados, são colocados num pequeno tubo de vidro ou "pescados" com um laço feito de nylon, fibra de vidro ou outro material, dependendo da preferência do investigador. O tubo ou laço é depois montado no aparelho de raios-X, diretamente no trajeto do feixe de raios-X. A força abrasiva dos poderosos feixes de raios-X pode perfurar os cristais que ficarem demasiado tempo à sua frente. Para minimizar os danos causados pela radiação, os investigadores congelam os seus cristais em azoto líquido.
Fotos dos cristais cedidas por Alex McPherson, University of California, Irvine.
Porquê raios-X?
Para se poder medir algo com precisão, é necessária uma escala adequada. Para medir a distância entre cidades, usam-se quilómetros ou milhas. Para medir uma mão, usam-se centímetros ou polegadas.
Os cristalógrafos medem distâncias entre átomos em angströms. Um angström é equivalente a 10-10 metros. É mais de 10 milhões de vezes mais pequeno que o diâmetro do ponto no final desta frase.
As melhores "réguas" para medir distâncias em angströms são os raios-X. Os raios-X usados pelos cristalógrafos
têm aproximadamente entre 0,5 e 1,5 angströms – o tamanho adequado para medir a distância entre átomos numa molécula.
E não há melhor local para gerar estes raios-X do que um sincrotrão.
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Espreitar as fábricas de proteínas
Os ribossomas fazem a matéria-prima da vida: são as fábricas de proteínas de todos os seres vivos, produzindo desde as toxinas bacterianas até às enzimas digestivas.
Imagem de Catherine Lawson, Rutgers University e RCSB Protein Data Bank.
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Para a maioria das pessoas, os ribossomas são extremamente pequenos: dezenas de milhares de ribossomas caberiam na ponta afiada de um lápis. Mas, para um biólogo estrutural, os ribossomas são enormes. Contêm três ou quatro cadeias de RNA e mais de 50 pequenas proteínas. Todos estes componentes trabalham em conjunto como partes móveis de uma máquina complexa – uma máquina tão grande que foi impossível estudá-la com detalhe estrutural até recentemente.
Em 1999, os investigadores determinaram a estrutura cristalina de um ribossoma completo pela primeira vez. O trabalho foi um triunfo técnico para a cristalografia. Mesmo hoje, o ribossoma continua a ser a maior estrutura complexa obtida por cristalografia. (Foram determinadas algumas estruturas virais maiores, mas a simetria destas estruturas simplificou muito o processo.)
Esta imagem inicial foi como um esboço que mostrou como é que as várias partes do ribossoma encaixam e onde é que as novas proteínas são feitas. Hoje em dia, os cientistas possuem imagens extremamente detalhadas dos ribossomas nas quais podem localizar, com precisão, a posição real de cada átomo.
Para além de oferecerem uma valiosa perspetiva deste componente e processo celular crucial, os estudos estruturais dos ribossomas podem levar a aplicações clínicas. Muitos dos antibióticos atuais interferem com a função dos ribossomas das bactérias prejudiciais, deixando intactos os ribossomas humanos. Um conhecimento mais detalhado das diferenças estruturais entre ribossomas bacterianos e humanos pode ajudar os cientistas a desenvolver novos antibióticos ou a melhorar os já existentes.
Radiação sincrotrónica — Uma das luzes mais brilhantes da Terra
Cortesia do Argonne National Laboratory
Imagina um feixe de luz 30 vezes mais potente do que o Sol, concentrado num ponto mais pequeno do que a cabeça de um alfinete. Este feixe tem um poder equivalente ao de um meteoro a atravessar a atmosfera. E é a ferramenta mais poderosa ao dispor dos cristalógrafos de raios-X.
Esta luz, uma das mais brilhantes da Terra, não é visível para os nossos olhos. É feita de feixes de raios-X gerados em grandes máquinas chamadas sincrotrões. Estas máquinas aceleram partículas com carga elétrica, muitas vezes eletrões, até velocidades próximas às da luz e depois fazem-nas girar num enorme anel metálico oco.
Os sincrotrões foram originalmente concebidos para serem usados por físicos que estudam partículas subatómicas e fenómenos cósmicos. Outros cientistas rapidamente se uniram às instalações para procurar aproveitar o que os físicos consideravam um subproduto indesejável – as brilhantes "explosões" de raios-X.
O maior componente de cada sincrotrão é o seu anel de armazenamento de eletrões. Na verdade, este anel não é um círculo perfeito, mas um polígono de muitos lados. Em cada vértice do polígono, ímanes perfeitamente alinhados curvam o feixe de eletrões, forçando-o a manter-se dentro do anel (sem isso, as partículas viajariam em linha reta e colidiriam com a parede do anel). Cada vez que o percurso dos eletrões é desviado, eles emitem pulsos de energia sob a forma de radiação eletromagnética.
Este fenómeno não é exclusivo dos eletrões ou das partículas nos sincrotrões. Sempre que uma partícula carregada muda de velocidade ou direção, emite energia. O tipo de energia, ou radiação, que a partícula emite depende da sua velocidade e do grau em que são desviadas. Uma vez que num sincotrão as partículas viajam próximo da velocidade da luz, a radiação que emitem é intensa, incluindo raios-X de elevada energia.
Cientistas sintonizados no sincrotrão
Os sincrotrões são apreciados, não só pela sua capacidade em produzir raios-X brilhantes, mas também pela possibilidade de "sintonização" desses raios. Os cientistas podem selecionar os raios com o comprimento de onda mais adequado às suas experiências.
Para determinar a estrutura de uma molécula, os cristalógrafos geralmente têm que comparar várias versões de um cristal – um cristal puro e vários outros em que a molécula cristalizada está "ensopada" em diferentes metais pesados, como mercúrio, platina ou urânio.
Como estes metais pesados têm muitos eletrões, dispersam mais os raios-X do que os átomos mais leves e pequenos das moléculas biológicas. Comparando os padrões de difração do cristal puro com os dos vários cristais com metais, os investigadores podem determinar a localização dos metais no cristal. Estes átomos metálicos servem de referencial para o cálculo das posições de todos os outros átomos da molécula.
Mas, quando os investigadores usam a radiação de raios-X do sincrotrão, não têm que obter várias versões da mesma molécula cristalizada, o que representa uma grande poupança de tempo e dinheiro. Em alternativa, constroem um só tipo de cristal, que contém selénio, em vez de enxofre, em todos os aminoácidos metionina. Depois "sintonizam" o comprimento de onda do feixe do sincrotrão para corresponder a certas propriedades do selénio. Desta forma, um único cristal substitui vários cristais com metais. Esta técnica é chamada de MAD, de Multiwavelength Anomalous Diffraction (Difração Anómala de Múltiplos Comprimentos de Onda).
Com a MAD, os investigadores bombardeiam os cristais contendo selénio três ou quatro vezes, com raios-X de diferentes comprimentos de onda – incluindo uma sessão com raios-X do comprimento de onda exatamente igual ao que é absorvido pelos átomos de selénio. A comparação dos padrões de difração resultantes, permite aos investigadores localizar os átomos de selénio que, de novo, servem como pontos de referência a partir dos quais toda a restante estrutura é calculada.
Os brilhantes raios-X dos sincrotrões permitem aos investigadores a recolha dos dados brutos muito mais rapidamente do que com as fontes tradicionais, que são pequenas o suficiente para caber numa grande mesa de laboratório, mas produzem raios-X mais fracos do que os dos sincrotrões. O que costumava demorar semanas ou até meses no laboratório, pode agora ser feito em minutos num sincrotrão. Mas, depois os dados têm ainda que ser analisados, refinados e corrigidos antes de se poder visualizar a proteína no seu esplendor estrutural tridimensional.
O número e a qualidade das estruturas moleculares determinadas por difração de raios-X aumentou acentuadamente nos últimos anos, bem como a percentagem destas estruturas obtidas em sincrotrões. Esta tendência promete continuar devido, em grande parte, a novas técnicas como a MAD e ao poder incomparável da radiação sincrotrónica.
Para além do seu papel na revelação de estruturas moleculares, os sincrotrões são usados numa variedade de aplicações, incluindo o design de chips de computadores, a testagem de medicamentos em células vivas, o fabrico de plásticos, a análise da composição de materiais geológicos e o estudo de técnicas de imagiologia médica e radioterapia.
Perfil de um estudante: A ciência trouxe um estudante da costa da Venezuela ao coração do Texas
"A ciência é como uma montanha russa. Começas muito entusiasmado com o que estás a fazer. Mas, se as experiências não correm bem, ficas desanimado. Depois, do nada, consegues bons dados e estás de novo nas nuvens."
Foto: Marsha Miller, University of Texas at Austin
É assim que Juan Chang descreve a natureza da ciência. Ele licenciou-se em Bioquímica e Ciência dos Computadores na University of Texas at Austin. Também trabalhou no laboratório de cristalografia de raios-X de Jon Robertus na UT-Austin.
Chang estudou a proteína que evita que as células cometam suicídio. Tal como um escultor retira lascas da mármore, também o corpo, durante o desenvolvimento normal, usa o suicídio celular, também chamado de apoptose, para moldar feições como as dos dedos. Para proteger as células saudáveis, o corpo também desencadeia a apoptose para matar as células que têm problemas genéticos ou que estão infetadas por vírus.
Ao conhecer melhor as proteínas envolvidas na causa ou prevenção da apoptose, os cientistas esperam poder controlar o processo em situações particulares: para tratar tumores e infeções virais pela promoção da morte das células afetadas e para tratar doenças nervosas pela prevenção da apoptose em células nervosas. Uma melhor compreensão da apoptose pode até permitir aos investigadores fazer crescer tecidos para transplante de órgãos mais facilmente.
Estudante de Doutoramento
Baylor College of Medicine
Chang fez parte deste processo ao ajudar a determinar a estrutura cristalográfica de raios-X de uma proteína a que os cientistas chamam ch-IAP1. Utilizou técnicas bioquímicas para obter grandes quantidades desta proteína purificada. O passo seguinte será cristalizar a proteína e depois usar a difração de raios-X para obter a sua estrutura detalhada a três dimensões.
Chang chegou ao Texas vindo de uma cidade à beira lago na ponta noroeste da Venezuela. Interessou-se pelas Ciências Biológicas ainda no Ensino Secundário. A sua turma fez uma visita de estudo a uma ilha na costa da Venezuela para observar o complexo balanço ecológico das praias e barreiras de coral. Ficou impressionado com o modo como cada planta e animal – caranguejos, insetos, aves, roedores e algas – se adaptaram ao vento, ondas e sal costeiros.
Na mesma época, a sua escola participou numa angariação de fundos para ajudar vítimas da doença de Huntington, uma doença genética incurável que lentamente vai provocando uma degeneração progressiva das capacidades de mobilidade e capacidades intelectuais das pessoas afetadas. Maracaibo, a cidade onde Chang cresceu, é também a cidade de onde é originária a mais numerosa família com a doença de Huntington. Através do impulso dado por essa angariação de fundos, Chang interessou-se pela base genética das doenças hereditárias.
O seu conselho para quem queira enveredar por uma carreira científica é "meter as mãos na massa" e experimentar trabalhar em diferentes campos. Ele interessou-se inicialmente pela Genética, fez investigação em Bioquímica e agora está num programa de Doutoramento na Baylor College of Medicine. O programa combina a Biologia Estrutural e Computacional com a Biofísica Molecular. Depois de terminar o Doutoramento, espera tornar-se professor universitário.
O que significa a estrutura tridimensional detalhada de proteínas?
O que é a cristalografia de raios-X?
Refere duas razões que expliquem porque é que os sincrotrões são tão importantes para os cristalógrafos de raios-X.
O que é um ribossoma e porque é que é importante estudá-lo?
Tradução conjunta de Diana Barbosa e da equipa coordenada por José Pissarra (Maria Susana Jorge Pereira, Luís Gustavo de Carvalho Pereira,
Maria Fernanda Fidalgo Ferro de Beça, Armando Jorge Gomes Teixeira, Armando Jorge Gomes Teixeira e Fernando Manuel dos Santos Tavares).
Revisão científica de Maria João Guimarães Fonseca.